Репрограммирование экзокринных клеток поджелудочной железы в эндокринные β-клетки у мышей

http://www.celltranspl.ru/news/newspost29

Сахарный диабет (СД) 1-го типа (называемый также инсулинзависимым СД) – наиболее частое заболевание эндокринной системы человека, и наряду с онкологическими и сердечно-сосудистыми заболеваниями – одна из главных проблем здравоохранения во всем мире. В основе патогенеза СД 1-го типа лежит аутоиммунная атака секретирующих инсулин β-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы (ПЖ), что приводит к гибели последних и прогрессирующей недостаточности инсулина. До недавнего времени постоянные инъекции инсулина с контролем глюкозы крови и гликогемоглобина были единственным способом компенсации СД 1. Разработанный в конце 90-х годов и прошедший к 2006 году первые клинические испытания Эдмонтоновский протокол аллогенной трансплантации островковых клеток для лечения лабильного («brittle-type») СД 1 с частыми эпизодами гипогликемии открыл новую страницу в истории СД, дав миллионам пациентов надежду на адекватную компенсацию без необходимости постоянных инъекций инсулина [1, 2]. Однако в используемых на настоящий момент вариантах данного протокола лишь менее половины пациентов сохраняют независимость от инсулина через год после трансплантации. Помимо этого, подобное лечение связано с необходимостью пожизненной иммуносупрессивной терапии для предотвращения алло- (реакция «хозяин против транплантата») и аутоиммунного (продолжающаяся эндогенная аутоиммунная атака) отторжения трансплантированных β-клеток. Поэтому число работ, посвященных разработке новых методов лечения СД 1, неуклонно увеличивается.

Одним из потенциальных способов лечения различных заболеваний, связанных с утратой клеток определенного генеза (в частности, СД 1) является «репрограммирование» дифференцированных, присутствующих в больших количествах клеток взрослого организма в плюрипотентные стволовые клетки с последующей их дифференцировкой в клетки с необходимым фенотипом, в случае СД 1 – в продуцирующие инсулин β-клетки. Альтернативой подобному подходу является прямое репрограммирование одного типа дифференцированных клеток в другой. Авторам опубликованной в Nature статьи «In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to β-cells» (Zhou с соавторами) при помощи аденовирусной доставки генов трех транскрипционных факторов, специфичных для β-клеток, удалось добиться in vivo конверсии зрелых экзокринных клеток ПЖ в полностью функциональные, инсулин-продуцирующие β-клетки. Для репрограммирования были выбраны экзокринные клетки ПЖ, поскольку их объединяет с β-клетками общий энтодермальный предшественник [3], а также в связи с тем, что при культивировании экзокринных клеток in vitro эндокринная программа «включается» в них спонтанно [4, 5]. Помимо этого, было показано, что аденовирусные векторы преимущественно инфицируют именно экзокринные клетки [6], и поскольку бóльшая часть естественных β-клеток находится внутри островков Лангерганса, любые β-клетки, образовавшиеся de novo, могут быть легко идентифицированы при иммунофлуорецсентном анализе тканевых срезов как инсулинпозитивные клетки вне островков Лангерганса.

В ранее опубликованных работах той же группы при помощи in situ гибридизации был проведен скрининг более 1100 транскрипционных факторов, что позволило идентифицировать группы транскрипционных факторов, специфично экспрессирующихся в различных типах клеток эмбриональной ПЖ [7]; в частности, была идентифицирована группа, состоящая по меньшей мере из 20 транскрипционных факторов, экспрессия которых в эмбриональной поджелудочной железе ограничена β-клетками и/или их эндокринными предшественниками. Для дальнейшего анализа были выбраны 9 транскрипционных факторов (Pdx1, Ngn3, NeuroD, Nkx2.2, Nkx6.1, Pax4, Pax6, Isl1 и MafA), поскольку только соответствующие мутантные гены демонстрировали фенотип, связанный с развитием β-клеток [8,9]. В ходе первоначальных экспериментов, смесь из 9 аденовирусных бицистронных векторов (M9), каждый из которых содержит разделенные IRES-элементом индивидуальный транскрипционный фактор и GFP, слитый с сигналом ядерной локализации (nGFP), чрезкожно вводили в поджелудочные железы двухмесячных иммунодефицитных RAG-нокаутных мышей. Через месяц после инъекции умеренное повышение содержания неостровковых инсулинпозитивных β-клеток наблюдали в поджелудочных железах двух из трех инфицированных животных. Для определения минимального набора транскрипционных факторов, необходимых для конверсии экзокринных клеток в β-клетки, из пула аденовирусных векторов удаляли по одному вектору, и полученные смеси 8 векторов снова вводили в поджелудочные железы животных. Было показано, что удаление векторов, кодирующих Nkx2.2, Nkx6.1 или Pax4 не оказывает существенного влияния на продукцию не-островковых β-клеток. Данные, полученные при удалении каждого из остальных векторов, были слабоинтерпретируемыми. Смесь этих шести векторов (M6) авторы подвергли второму раунду поочередной деплеции составляющих, в результате чего было выяснено, что абсолютно необходимыми для конверсии инфицированных nGFP-позитивных экзокринных клеток в инсулинпозитивные β-клетки являются три транскрипционных фактора - Ngn3, Mafa и Pdx1 (смесь M3): удаление каждого из соответствующих векторов из пула M6 приводило к снижению процента инсулинпозитивных клеток среди инфицированных nGFP-позитивных клеток к уровню, наблюдаемому при инфицировании животных контрольным вектором, кодирующим только nGFP. Напротив, удаление векторов, кодирующих Pax6 и Isl1, не приводило к снижению процента генерированных de novo β-клеток к общему числу клеток, инфицированных смесью векторов. Удаление вектора, кодирующего NeuroD, умеренно снижало процент инсулинпозитивных клеток, а замена Ngn3 на NeuroD в смеси M3 приводила к получению смеси, статистически значимо отличающейся от контроля по эффективности генерирования инсулинпозитивных клеток, однако намного менее эффективной, чем изначальная смесь M3.

Репрограммирующий эффект M3, по-видимому, достаточно специфичен для экзокринных клеток ПЖ, поскольку эффективное (коэкспрессия всех трех факторов) инфицирование этой смесью тканей скелетных мышц in vivo и фибробластов in vitro не приводило к появлению инсулинпозитивных клеток. Происхождение генерированных β-клеток из экзокринных клеток ПЖ было подтверждено двумя способами. Так, было показано, что >95% инфицированных контрольным вектором клеток ПЖ коэкспрессируют nGFP и амилазу (маркер экзокринных клеток), в то время как клетки, коэкспрессирующие nGFP и маркеры других типов клеток, в норме присутствующих в ПЖ, суммарно составляли менее 5% инфицированных nGFP-позитивных клеток.

Прямое доказательство происхождения генерированных β-клеток из экзокринных клеток ПЖ было получено с использованием генетического подхода. Гомозиготных мышей линии Cpa1CreERT2 [7], под действием тамоксифена индуцибельно экспрессирующих Cre-рекомбиназу селективно в экзокринных клетках ПЖ, скрещивали с гомозиготными мышами репортерной линии R26R, в которых ген LacZ, кодирующий β-галактозидазу, встроен в убиквитарно экспрессируемый локус ROSA26 и отделен от промоторной области стоп-кассетой, фланкированной loxP-сайтами. После введения в полученных «двойных» гетерозиготных мышей тамоксифена, экспрессируемая только в экзокринных клетках Cre-рекомбиназа вырезала фланкированную loxP-сайтами стоп-кассету перед LacZ, приводя к селективной экспрессии β-галактозидазы в 5-10% экзокринных клеток их потомства. Последующая инъекция M3 приводила к появлению множества клеток, коэкспрессирующих β-галактозидазу и инсулин, что однозначно подтверждает происхождение генерированных β-клеток из экзокринных клеток ПЖ.

Полученные инсулинпродуцирующие клетки демонстрировали все морфологические признаки β-клеток как in situ в тканевых срезах, так и при диссоциации в культуре. Иммунофлуоресцентный анализ продемонстрировал экспрессию всех основных генов, продукты которых вовлечены в функционирование β-клеток (Glut2, GCK, Pcsk1), а также ключевых β-клеточных транскрипционных факторов (NeuroD, Nkx2.2 и Nkx6.1). Индуцированные β-клетки не экспрессировали маркеров, специфичных к другим типам клеток ПЖ, в том числе других гормонов ПЖ. По данным сравнительного анализа экспрессионного профиля nGFP-позитивных клеток мышей, инфицированных M3, и клеток островков Лангерганса тех же мышей, количество транскриптов, сверхэкспрессированых в этих клеточных популяциях по сравнению с не-островковыми GFP-негативными клетками, составило 2051 и 2060 соответственно, из них число транскриптов, перекрывающихся между этими двумя популяциями, составило 1501, т.е. более 70%. Также было показано, что, как и естественные β-клетки, индуцированные инсулинпозитиваные клетки вызывают локальное ремоделирование васкулярной сети для облегчения высвобождения инсулина в циркуляцию. Подобно естественным β-клеткам, индуцированные инсулинпозитивные клетки экспрессируют VEGF и через 10 и 30 дней после инфекции M3, периваскулярное расположение демонстрировали 61% и 83% индуцированных nGFP-положительных клеток, в то время как при инфекции контрольным вектором этот показатель составил 32%.

Эффективность индуцированных β-клеток в отношении секреции инсулина в циркуляцию была показана с использованием индукции диабета при помощи специфической абляции естественных β-клеток стрептозотоцином (STZ) с последующей (спустя неделю после инъекции STZ) инфекцией животных смесью векторов M3. С момента инфицирования животных M3 или контрольным вектором, уровень глюкозы крови (натощак) у мышей, получавших M3, был значительно ниже по сравнению с мышами, получавшими контрольный вектор с nGFP, причем этот эффект был стабилен даже через 9 недель после инъекции стрептозотоцина. По сравнению с мышами, получавшими контрольный вектор, животные, получавшие M3, демонстрировали бóльшую толерантность к глюкозе и более высокие сывороточные уровни инсулина. Таким образом, генерированные de novo инсулинпозитивные клетки являются полноценными функциональными β-клетками.

Важным результатом является также то, что, индуцирующие β-клеточную программу факторы необходимы и присутствуют в инфицированных клетках лишь временно. Так, при помощи RT-PCR анализа экспрессии вирусных трансгенов (по одному прямому праймеру на каждый из трех трансгенов и один и тот же обратный праймер, специфичный к IRES-элементу) было показано, что экпрессия всех трех трансгенов в поджелудочных железах экспериментальных животных значительно снижена через месяц после инфекции и не детектируется через 2 месяца после инфекции. Иммунофлуоресцентный анализ продемонстрировал отсутствие экспрессии белкового продукта Ngn3 в индуцированных β-клетках через месяц после инфекции, однако экспрессия Pdx1 и Mafa оставалась по-прежнему выраженной, что с учетом данных RT-PCR - анализа (см. выше) указывает на активацию эндогенных генов. Важно отметить, что эти данные находятся в согласии с тем фактом, что зрелые дифференцированные β-клетки не экспрессируют Ngn3, однако экспрессируют Pdx1 и Mafa [8,9], т.е. Ngn3 необходим для индукции трансдифференцировки, но не для поддержания β-клеточного фенотипа.

Главными достоинствами данного исследования по сравнению с предыдущими попытками репрограммирования дифференцированных клеток (гепатоциты [10-13], экзокринные клетки ПЖ [14-17], эпителий протока ПЖ [19,20]) в β-клетки являются исчерпывающие и мультимодальные (микроскопия, иммуногистохимия, RT-PCR, экспрессионный профиль) доказательства «чистой» β-клеточной природы репрограммированных клеток, тогда как в большинстве других исследований репрограммирование было либо явно частичным (экспрессия некоторых β-клеточных генов, но отсутствие морфологических и фенотипических признаков, характерных для β-клеток), либо проведенный анализ не исключал гибридного фенотипа.

В то же время, по данным других авторов, для «включения» β-клеточной программы в экзокринных клетках in vitro, по-видимому, достаточно простой диссоциации в культуре [14-17]. Механизм этого эффекта неясен, а часть получаемых таким образом β-клеток демонстрирует гибридный фенотип, экспрессируя маркеры экзокринных клеток ПЖ, однако полученные β-клетки продуцируют инсулин и эффективно восстанавливают нормогликемию в модели аллоксан-индуцированного диабета. Поэтому на данном этапе исследований, при всей ценности данной работы в качестве «proof-of-principle»-исследования, демонстрирующего конверсию дифференцированных экзокринных клеток ПЖ в полностью функциональные и стабильные in vivo β-клетки при помощи транзиторной коэкспрессии всего трех транскрипционных факторов, потенциальные практические преимущества подобного подхода перед простой диссоциацией экзокринных клеток ПЖ в культуре пока не вполне ясны. В любом случае, помимо своей академической ценности, данная работа привнесла в арсенал потенциальных способов лечения СД 1 еще одну интересную модальность.

Еще одной проблемой, связанной с потенциальным практическим применением как описанного Zhou c соавторами, так и других подобных способов лечения СД 1, является дальнейшая судьба трансплантированных β-клеток. В отличие, например, от инфаркта миокарда, при котором поражение ткани носит одномоментный характер, и генерированным подобным образом кардиомиоцитам может угрожать только следующий инфаркт, СД 1 – хроническое аутоиммунное заболевание, и эксплант генерированных in vitro β-клеток неизбежно постигнет та же участь, что ранее постигла естественные β-клетки. Поэтому несмотря на «пациент-специфичность» подобных подходов, вопрос пост-трансплантационной иммуносупрессии стоит столь же остро, как и в Эдмонтоновском протоколе, с той лишь разницей, что во втором случае на первый план выходит коррекция аллоиммунной реакции «хозяин против трансплантанта». Одними из наиболее перспективных способов иммунокоррекции в подобных случаях являются различные протоколы аутотрансплантации/индукции/увеличения пула циркулирующих регуляторных Т-лимфоцитов, см., к примеру, celltranspl.ru. Вполне возможно, что именно сочетания двух параллельных протоколов клеточной терапии, один из которых направлен на восстановление β-клеток, а другой - на коррекцию иммунологических нарушений, лежащих в основе аутоиммунной атаки островковых клеток ПЖ, являются наиболее перспективными и оптимальными для этиотропного/патогенетического лечения СД 1.

По материалам: Zhou Q., Brown J., Kanarek A., Rajagopal J., Melton D. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to β-cells. Nature 2008; 455 : 627-632

1. Shapiro A.M., Ricordi C., Hering B.J. et al. International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation. N. Engl. J. Med. 2006; 355(13): 1318-30. [Full Text]
2. Srinivasan P., Huang G.C., Amiel S.A. et al. Islet cell transplantation. Postgrad. Med. J. 2007; 83(978): 224-9. [Abstract]
3. Gu G., Dubauskaite J., Melton D.A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN31 cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development 2002; 129(10), 2447-57. [Full Text]
4. Baeyens L., De Breuck S., Lardon J. et al. In vitro generation of insulin-producing beta cells from adult exocrine pancreatic cells. Diabetologia 2005; 48(1): 49-57. [Abstract]
5. Minami K., Okuno M., Miyawaki K. et al. Lineage tracing and characterization of insulin-secreting cells generated from adult pancreatic acinar cells. PNAS 2005; 102(42): 15116-21. [Full Text]
6. Wang A.Y., Peng P.D., Ehrhardt A. et al. Comparison of adenoviral and adeno-associated viral vectors for pancreatic gene delivery in vivo. Hum Gene Ther. 2004; 15(4): 405-13. [Abstract]
7. Zhou Q, Law AC, Rajagopal J et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev. Cell. 2007; 13(1):103-14. [Abstract]
8. Murtaugh L.C., Melton D.A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2003; 19: 71-89 [Abstract]
9. Jensen J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Dev Dyn. 2004; 229(1): 176-200. [Abstract]
10. Wang A. Y., Ehrhardt A., Xu H. et al. Adenovirus transduction is required for the correction of diabetes using Pdx-1 or Neurogenin-3 in the liver. Mol. Ther. 2007; 15(2): 255–63. [Abstract]
11. Ferber S., Halkin A., Cohen H. et al. Pancreatic and duodenal homeobox gene 1 induces expression of insulin genes in liver and ameliorates streptozotocin-induced hyperglycemia. Nature Med. 2000; 6(5): 568–72. [Abstract]
12. Kaneto H., Nakatani Y., Miyatsuka T. et al. PDX-1/VP16 fusion protein, together with NeuroD or Ngn3, markedly induces insulin gene transcription and ameliorates glucose tolerance. Diabetes 2005; 54(4): 1009–22. [Full Text]
13. MiyatsukaT., Kaneto H., Kajimoto Y. et al. Ectopically expressed PDX-1 in liver initiates endocrine and exocrine pancreas differentiation but causes dysmorphogenesis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003; 310(3): 1017–25. [Abstract]
14.  Baeyens L., De Breuck S., Lardon J. et al. In vitro generation of insulin-producing beta cells from adult exocrine pancreatic cells. Diabetologia 2005; 48(1): 49–57. [Abstract]
15. Minami K., Okuno M., Miyawaki K. et al. Lineage tracing and characterization of insulin-secreting cells generated from adult pancreatic acinar cells. PNAS 2005; 102(42): 15116–21. [Full Text]
16. Minami K., Seino S. Pancreatic acinar-to-beta cell transdifferentiation in vitro. Front. Biosci. 2008; 13: 5824–37. [Abstract]
17. Okuno M., Minami K., Okumachi A. et al. Generation of insulin-secreting cells from pancreatic acinar cells of animal models of type 1 diabetes. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2007; 292(1): E158–E165. [Full Text]
18. Sapir T., Shternhall K., Meivar-Levy I. et al. Cell-replacement therapy for diabetes: generating functional insulin-producing tissue from adult human liver cells. PNAS 2005; 102: 7964–9. [Full Text]
19. Heremans Y., Van De Casteele M., in't Veld P. et al. Recapitulation of embryonic neuroendocrine differentiation in adult human pancreatic duct cells expressing neurogenin 3. J. Cell Biol. 2002; 159(2): 303–12. [Full Text]
20. Gasa R., Mrejen C., Leachman N. et al. Proendocrine genes coordinate the pancreatic islet differentiation program in vitro. PNAS 2004; 101(36): 13245–50. [Full Text]