Preparatele celulare şi de ţesuturi în medicina regenerativă (tratamentul arsurilor)

Experienţa noastra de lucru cu preparatele de sânge enumără 30 de ani: această perioadă include cercetări experimentale de crioconservare a tuturor populaţiilor celulare din sângele periferic, măduvă osoasă cadaverică şi de donator, a celulelor hematopoietice embrionare de ficat de animale şi umane, de sânge ombilical. Preparatele obţinute au trecut testările din punct de vedere clinic şi ş-au găsit aplicarea nu numai în practica clinică, dar şi în zootehnie. Folosirea sângelui ombilical la clinică a fost precedată de o lungă etapă de cercetări experimentale de elaborare a metodei de crioconservare. O atenţie deosebită a fost acordată condiţiilor de obţinete, conservare şi de fracţionare a mononuclearelor, precum şi elaborării programului de congelare. Ca urmare, s-au stabilit parametrii de funcţionare de răcire, prelungită păstrare precum şi de decongelare, care permit păstrarea de 90-95% de celule hematopoietice din cordonul de sânge în stare viabilă. Trebuie să fie subliniat faptul, că într-un eşantion de sânge ombilical sunt de 700 de ori mai puţine celule hematopoietice, decât este necesar pentru transplantarea destinatarului adult, de aceea a fost necesar să se excludă pierderea de celule la toate etapele procesului tehnologic.

Sângele ombilical este sursa cea mai preferată de celule stem din multe puncte de vedere. În primul rând, nu există probleme etice, care interzic primirea acestuia, în al doilea rând, - facilitatea procedurii de selectare a mononuclearelor, în al treilea rând, după conţinutul celulelor stem şi celulelor timpurii predecesori, acesta nu este mai puţin preţios decât măduva osoasă, dar după capacitatea proliferativă - este mai preţios. În plus, atunci când se compară compoziţia celulelor limfoide din sângele periferic şi cablul de sânge au fost relevate diferenţe semnificative în compoziţia lor subpopulaţională în sângele din cordonul ombilical predomină celule supresori neactivate, imature, ce exclude dezvoltarea bolii transplantantului contra titulrului, chiar şi atunci când se utilizează celule stem din cordonul de sânge cu compatibilitate incompletă NLA.

Experienţa mondială de utilizare a celulelor stem din cordonul de sânge în tratamentul hemablastozelor, patologiilor ereditare de celule din sânge şi bolile de natură netumorală este destul de largă, dar, aşa cum se arată în multe lucrări, spectrul de activitate a celulelor nu este limitat la restaurarea sistemului de formare a sângelui, reacţia organismului la introducerea preparatului nu este previzibilă: pot fi eliminate patologiile de celule nervoase, se regenera parenchimul ficatului şi celulele din pancreas, se normalizează homeostazia, etc

Un interes special reprezinţă populaţia celulelor stem mezenhimale, care, atunci când sunt cultivate în anumite condiţii, pot să se transforme în fibroblaste, celulele ţesuturilor osos, de grăsimi şi fibros.

Material de bază pentru cultivarea celulelor în cultură servesc celulele stem mezenhimale (CD34-), care au fost identificate pentru prima dată de A . Fridenstein (et al., 1973) din măduva osoasă.

CD34-celule negative- predecesori ai măduvei osoase pot părăsi nişa şi a їntra în fluxul sanguin. Nimerind cu sângele în micromediul corespunzător, ele întră în interacţiune de semnal-reglementare cu celulele mature şi formează un cadru stromal, pe care poate fi diferenţierea acestora în ţesut glial şi fibroblaste. Celulele imature mezenhimale, care circulă în sânge pote reveni la stromalul ţesutului medular şi s[ se transforme într-SD34 - celule pozitive hematopoietice/ Schuldiner, 2000/.

De asemenea, s-a demonstrat că, în caz de daune localizate, celulele stem mezenhimale primesc semnale, provenite de la ţesuturile distruse, care pun în mişcare mecanismele de reglementare reparativă/ Tavasolli et al., 1991/.

Cercetările privind aplicarea celulelor stem mezenhimale alogene similare fibroblastelor pentru tratarea arsurilor profunde au fost efectuate de Shumakov şi al. (2003). Ei au demonstrat, că la utilizarea celulelor stem mezenhimale alogene similare fibroblastelor viteza de vindecare a rănilor a fost mai mare decât la transplantarea de fibroblaste embrionare. În ultimele două decenii au fost folosite fibroblaste şi cheratinocite alogene cultivate, autofibroblaste şi autocheratinocite cu dermoplastica ulteruioară.

Celulele stem mezenhimale şi hematopoietice au fost găsite în sângele din cordonul ombilical / Nieda M, Nicol A, Denning-Kendal P et. Al. Endotelian cell precursors are normal component of human umbilical cord blood. Br J Haematol 1997; 98; 775-777/. În studiile experimentale a fost demonstrat, că în timpul de cultivare pe termen lung a a mononuclearelor din sângele ombilical, celullele endoteliale-predecesori sub acţiunea anumitor citochine formează in cultură colonii de fibroblaste.

Potenţialul repopulaţional al celulelor hematopoietice din sângele ombilical este confirmat cu o mulţime de transplantări în tratarea multor boli, inclusiv şi a anemiilor aplastice /Gluckman et al., 1997/.

Boala de arsură, care se dezvoltă pe fonul unei vaste traume termice (mai mult de 10% din corp), include complexul numeroaseor sindroame clinice. Acestea sunt – şocul de arsură, toxemia acută de arsură, perioadă septicotoxică şi perioadă de reconvalescenţie. Fiecare etapă a bolii este însoţită de un tratament corespunzător.

În prezent, împreună cu metodele tradiţionale au fost aplicate preparate biologice de acţiune complexă, menită să restabilească homeostaza pacientilui, procesele de reparare si regenerare ale segmentelor de piele deteriorată şi parcursul bolii de arsură, în general.

Astfel, pentru tratamentul şi profilaxia anemiei în perioada şocului de arsură se folosesc preparatele, care conţin eritropoietina /Patentă № 458887 A61M1/38 /. În perioada toxemiei de arsură la dezvoltarea de complicaţii infecţioase se foloseşte ţesutul placentei ca imunomodulator.

În perioadă septicotoxică la schimbarea bandajelor traumatice, necroectomiile în etape se utilizează ţesutul placentar utilizat în compoziţia unguenteor, iar celulele de chorion sunt folosite sub formă de suspensie celulară, care sunt aplicate pe suprafaţă rănii (Preparatul "Suspesia celulelor de chorion» pentru tratamentul arsurilor, metoda de obţinere a acesteia şi metoda de tratament cu utilizarea acestui preparat 20040806939/K19.08.2004 A61K35/50).

La rănile cu o suprafaţă largă şi ulcerele trofice, rănile, care termen lung nu se vindecă în fazele de regenerare şi epitelizare, pe suprafaţă rănii se aplică o cultură de fibroblaste şi cheratinocite. Transplantarea culturii de celule este efectuată în mod independent, în asociere cu preparatele, care conţin colagen sau în combinaţie cu autodermoplastica /Patentă № 2002105467/.

Rezultale proprii

Datele de mai sus, precum şi propria experienţă de utilizare a celulelor stem hematopoietice în practica clinică / G.S. Lobyntseva, Y.V. Gladkikh şi alţii. Celule stem embrionare hematopoietice umane (teorie şi practică clinică), 2004 / a permis completarea tratamentului pacienţilor cu traume de arsură cu un complex de biopreparate, aplicarea cărora, în legătură cu gravitatea situaţiei, ar putea da rezultate pozitive (figura 1).

Fig. 1

Pacient N., 51 ani, a fost admis la clinică cu traumă de arsură vastă de 36% din corp. Arsura adâncă termică a cauzat dezvoltarea la pacient a bolii de arsură de gradul 3-4, care se caracteriza prin şoc sever de arsură, arsura tractului respirator, sepsis şi dezvoltarea pneumoniei septice (Fig. 2).

Fig. 2

Pentru înlăturarea dezvoltării stării anemice la pacient, la a 2-ua zi, pe fonul unei scăderii bruste a indicilor de hemoglobină, eritrocite şi leucocitele, au fost introduse în mod intzravenal şi sub formă de picături celulele stem crioconservate din cordonul de sânge în cantitate de 0,2x109 de celule cu nucleu (fig. 3).

Fig. 3

Tactica de tratament a pacienţilor cu leziuni de arsuri ale pielii de gradul IIIB-IV pentru reducerea intoxicaţiei şi înlăturarea complicaţiilor prevede înlăturarea suprafeţelor deteriorate ale pielii.

Fig. 4

A 2-a zi au fost efectuate secţiuni decompresionale (Fig. 4), iar la a 4-a zi - extirparea bloc-fascială a ţesutulrilor necrotice (8% din suprafaţa totală a corpului) pe abdomen şi piept (fig. 5).

Fig. 5

Pe suprafeţele rănii în zona abdomenului şi pieptului a fost aplicată suspensia de celule epiteliale, în număr de 1-2x106 /ml, şi a fost învelită cu ţesut de chorion (Fig. 6).

Fig. 6

Ca urmare a manipulărilor efectuate, termenii pănă la efectuarea autodermoplasticii a fost reduşi cu 6-7 zile. Reacţii autoimune la aplicarea preparatelor biologice nu se urmăreau, în rezultatul cărora a avut loc engraftmentul complet al autotransplantantului fără respingerea ţesutului din lisis. Acest lucru a ajutat la conservarea resurselor limitate ale propriei pieli.

Granularea şi epitelizarea treceau rapid şi fără un proces pronunţat inflamator, ce a dus la reducerea formării cicatricilor deformante şi contracturilor.

Fig. 7

РRana, tratată cu preparate biologice, a rămas curată, fără a fi exprimată plazmorea. Sa constatat, că pe suprafeţele, care au fost tratate cu celule embrionare epiteliale şi au fost acoperite cu ţesuturi crioconservate de chorion, vindecarea rănii era cu mult mai repede decât fără acestea. Suprafaţa de rană în locurile de vătămare dermică adâncă se acoperea cu un strat neted de ţesut granular, în înteriorul căruia erau vizibile sectoare cu extinderea buclelor terminale ale reţelei vasculare (Figura 7).

La a 17-a zi rana a fost gata pentru efectuarea autodermoplasticii (fig.8, 9).

Fig. 8

În timpul bandajelor s-au făcut printuri, care arată celule cu lungi filopodii, mari nuclee şi 1-2 nucleoli.

Sectorul braţului stâng, după înlăturarea pielii, a fost închis cu ţesut de chorion, după lisis pe zona rănii au fost aplicate fibroblaste, cultivate în cultură.

Rezultatele examinării sângelui periferic al pacienţilului pe parcursul lunii au arătat o dinamică stabilă şi o lipsă de stare de anemie (indicatorii de hemoglobină şi eritrocite, a se vedea Fig. 12)

Fig. 9

Modificări semnificative ale parametrilor biochimici nu au fost identificate (figura 10).

Creşterea proteinei totale pe termen scurt a fost observată ca răspuns la transplaţia autopielii.

Fig. 10

Creatinina şi probele hepatice au rămas stabile pe tot parcursul procesului de tratament.

Utilizarea preparatelor biologice include mecanismele de regenerare fiziologică şi proliferare inflamatorie în sectorul rănii de arsură. Existenţa celulelor stem în chorion, nu exclude posibilitatea acestora de migraţie şi proliferare în rană.

Ca rezultat al acestor procese, observăm formarea ţesutului specializat granulat şi a elementelor conjunctive. Factorii de creştere, care se conţin în ţesuturile de chorion stimulează proliferarea celulelor de granuleză şi fibroblaste.

Continuarea monitorizării cursului de engraftment al autopielii, a arătat, că nu au existat complicaţii legate de respingerea de transplanturi, suprafaţa pielii a fost netedă şi strălucitoare (Fig.11).

Fig. 11

Astfel, cercetarile noastre au confirmat încă o dată utilitatea utilizării celulelor din sângele ombilical şi preparatelor complexului fetoplacentar pentru tratamentul rănilor de arsuri. Înaltul potenţial proliferativ a celulelor stem, conţinutul de factori de creştere în preparate, care stimulează diviziunea celulară, proprietăţile antigene reduse şi de bactericid fac biopreparatele unice şi de neînlocuit în combustiologie.