Клеточные и тканевые препараты в регенеративной медицине (лечение ожоговой болезни)

Наш опыт работы с препаратами крови исчисляется 30-летним стажем: этот период включает экспериментальные исследования по криоконсервированию всех клеточных популяций периферической крови, трупного и донорского костного мозга, гемопоэтических клеток эмбриональной печени животных и человека, кордовой крови. Полученные нами препараты прошли клинические испытания и нашли применение не только в клинической практике, но и животноводстве. Применению кордовой крови в клинике предшествовал долгий этап экспериментальных исследований по разработке методики криоконсервирования. Особое внимание было уделено условиям получения, хранения и фракционирования мононуклеаров, а также разработке программы замораживания. В результате были установлены режимные параметры охлаждения, длительного хранения и размораживания, позволяющие сохранить 90-95% гемопоэтических клеток кордовой крови в жизнеспособном состоянии. Следует подчеркнуть, что в одном образце кордовой крови содержится в 700 раз меньше гемопоэтических стволовых клеток, чем требуется для трансплантации взрослому реципиенту, поэтому необходимо было исключить потери клеток на всех этапах технологического процесса.

Кордовая кровь является наиболее предпочтительным источником стволовых клеток по многим параметрам. Во-первых, отсутствуют какие-либо этические проблемы, запрещающие ее получение, во-вторых, - легкость процедуры выделения мононуклеаров, в третьих, по содержанию стволовых и ранних клеток-предшественников она не уступает костному мозгу, а по пролиферативному потенциалу - превышает его. Кроме того, при сравнении состава лимфоидных клеток периферической и пуповинной крови выявлены существенные различия в их субпопуляционном составе: в пуповинной крови преобладают неактивированные, незрелые и клетки-супрессоры, что исключает развитие болезни трансплантат против хозяина, даже при использовании стволовых клеток пуповинной крови с неполной НLA-совместимостью.

Мировой опыт применения стволовых клеток кордовой крови в схеме лечения гемобластозов, наследственных патологий кроветворных клеток и заболеваний неопухолевой природы довольно обширен, однако, как показано во многих работах, спектр действия клеток не ограничивается только восстановлением системы кроветворения, реакция организма на введение препарата не предсказуема: могут устраняться патологии нервных клеток, восстанавливаться паренхима печени и клетки поджелудочной железы, нормализуется гомеостаз и др.

Особый интерес представляет популяция мезенхимальных стволовых клеток, которые при культивировании в определенных условиях, могут трансформироваться в фибробласты, клетки костной, жировой и фиброзной ткани.

Исходным материалом для выращивания клеток в культуре служат мезенхимальные стволовые клетки (CD34-), которые были впервые выделены А.Фриденштейном (Fridenstein et al., 1973) из костного мозга.

CD34-негативные клетки-предшественники костного мозга могут покидать нишу и выходить в кровоток. Попадая с кровью в соответствующее микроокружение, они вступают в сигнально-регуляторные взаимодействия со зрелыми клетками и образовывают стромальный каркас, на котором возможна их дифференцировка в глиальную ткань и фибробласты. Циркулирующие в крови незрелые мезенхимные клетки могут возвращаться в строму костномозговой ткани и превращаться в СD34-позитивные гемопоэтические клетки /Schuldiner, 2000/.

Было также показано, что при возникновении локальных повреждений, мезенхимальные стволовые клетки получают сигналы, исходящие от разрушенных тканей, которые запускают механизмы репаративной регуляции / Tavasolli et al., 1991/.

Исследования по применению аллогенных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток для лечения глубоких ожогов были проведены Шумаковым и соавт. (2003). Они показали, что при использовании аллогенных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток скорость заживления ран была выше, чем при трансплантации эмбриональных фибробластов. Последние два десятилетия стали применять культивированные аллогенные кератиноциты и фибробласты, аутокератиноциты и аутофибробласты с последующей дермопластикой.

Мезенхимальные и кроветворные стволовые клетки были обнаружены и в кордовой крови /Nieda M, Nicol A, Denning-Kendal P et. al. Endotelian cell precursors are normal component of human umbilical cord blood. Br J Haematol 1997; 98; 775-777/. В экспериментальных исследованиях было показано, что при длительном культивировании мононуклеаров кордовой крови эндотелиальные клетки-предшественники под действием определенных цитокинов образуют в культуре колонии фибробластов.

Репопуляционный потенциал гемопоэтических клеток кордовой крови подтвержден многочисленными трансплантациями при лечении многих заболеваний, в том числе и апластических анемий /Gluckman et al.,1997/.

Ожоговая болезнь, развивающаяся на фоне обширной термической травмы (более 10% тела), включает комлекс многочисленных клинических синдромов. Это - ожоговый шок, острая ожоговая токсемия, септикотоксический период и период реконвалесценции. Каждый этап заболевания сопровождается соответствующей тактикой лечения.

В настоящее время, наряду с традиционными методами, стали применять биологические препараты коммплексного действия, направленного на восстановление гомеостаза больного, процессы репарации и регенерации поврежденных участков кожи и течение ожоговой болезни в целом.

Так, для лечения и профилактики анемии в период ожогового шока применяют препараты, содержащие эритропоэтин / Патент №458887 A61M1/38/. В период ожоговой токсимии при развитии инфекционных осложнений применяют ткань плаценты в качестве иммуномодулятора.

В септикотоксический период при травматических сменах повязок поэтапных некроэктомиях применяют плацентарную ткань в составе мазей, а клетки хориона используют в виде клеточной суспензии, которые наносят на раневую поверхность (Препарат "суспензія клітин хоріону" для лікування опіків, спосіб його одержання і спосіб лікування із застосуванням цього препарату 20040806939/К19.08.2004 A61K35/50).

При обширных раневых поверхностях, при трофических язвах, длительно не заживающих ранах в фазах регенерации и эпителизации на раневую поверхность наносят культуру фибробластов и кератиноцитов. Трансплантацию культуры клеток осуществляют самостоятельно, в комбинации с коллагенсодержащими препаратами или в сочетании с аутодермопластикой /Патент №2002105467/.

Собственные результаты

Изложенные выше данные, а также собственный опыт применения стволовых гемопоэтических клеток в клинической практике /Г.С.Лобынцева, Ю.В.Гладких и др. Стволовые эмбриональные гемопоэтические клетки человека (теория и клиническая практика), 2004/, позволил дополнить обычную схему лечения пациента с ожоговой травмой комплексом биопрепаратов, применение которых, в связи с особой тяжестью случая, могло принести положительные результаты (рис.1) .

Рис. 1

Больной N., 51 год, поступил в клинику с обширной ожоговой травмой 36% тела. Глубокий термический ожог вызвал у пациента развитие ожоговой болезни 3-4 степени, которая характеризовалась тяжелым ожоговым шоком, ожогом дыхательных путей, сепсисом и развитием септической пневмонии (рис.2).

Рис. 2

Для устранения развития анемического состояния у больного на 2-й день на фоне резкого падения показателей гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов внутривенно-капельно были введены криоконсервированные стволовые клетки кордовой крови в количестве 0,2х109 ядросодержащих клеток (рис.3).

Рис. 3

Тактика лечения больных с обширными ожоговыми поражениями кожи IIIВ- IV степени для снижение интоксикации и устранения осложнений предусматривает удаление поврежденных участков кожи.

Рис. 4

На 2-ой день произведены декомпрессионные разрезы (рис.4), а на 4-ый - блочно-фасциальное иссечение некротических тканей (8% от общей поверхности тела) на животе и груди (рис. 5 ).

Рис. 5

На участки раны в области живота и груди нанесли суспензию эпителиальных клеток в количестве 1-2 х106 /мл и закрыли тканью хориона (рис.6).

Рис. 6

В результате проведенных манипуляций сроки до проведения аутодермопластики были сокращены на 6-7 дней. Аутоиммунных реакций на применяемые биологические препараты не наблюдали, вследствие чего произошло полное приживление аутотрансплантата без отторжения ткани и ее лизиса. Это способствовало сохранению ограниченных собственных ресурсов кожи.

Грануляция и эпителизация протекали ускоренно и без выраженного воспалительного процесса, что привело к снижению образования деформирующих рубцов и контрактур.

Рис. 7

Рана, обработанная биопрепаратами, оставалась чистой, без выраженной плазмореи. Было установлено, что на участках, которые обрабатывали эмбриональными эпителиальными клетками и закрывали криоконсервированной тканью хориона, заживление раны происходило значительно быстрее, чем без него. Поверхность раны в местах глубокого поражения кожи закрывалась ровным слоем гранулезной ткани, внутри которой видны участки с разрастанием терминальных петель сосудистой сети (рис 7).

На 17 сутки рана была готова для произведения аутодермопластики (рис.8,9).

Рис. 8

Во время перевязок были сделаны отпечатки, на которых видны клетки с длинными филоподиями, крупными ядрами и 1 -2-мя ядрышками .

Область левой руки после снятия кожи была закрыта тканью хориона, после его лизиса на область раны нанесли фибробласты, выращенные в культуре.

Результаты исследования периферической крови больного на протяжении месяца свидетельствовали о стабильной динамике и отсутствии анемического состояния (показатели гемоглобина и эритроцитов см. на рис. 12)

Рис. 9

Существенных изменений биохимических показателей не выявлено (рис.10).

Кратковременное увеличение общего белка наблюдали в ответ на трансплацию аутокожи.

Рис. 10

Креатинин и печеночные пробы оставались стабильными на протяжении всего процесса лечения.

Применение биологических препаратов включает механизмы физиологической регенерации и воспалительной пролиферации в области ожоговой раны. Наличие стволовых клеток в хорионе, не исключает также возможность их миграции и пролиферации в области раны.

В результате этих процессов мы наблюдаем образование специализированной гранулезной ткани и соединительнотканных элементов. Ростовые факторы, содержащиеся в ткани хориона стимулируют пролиферацию клеток гранулезы и фибробластов.

Дальнейшее наблюдение за течением процесса приживления аутокожи показало, что никаких осложнений, связанных с отторжением трансплантатов не было, поверхность кожи была гладкой и блестящей (рис.11 ).

Рис. 11

Таким образом, нашими исследованиями еще раз подтверждена целесообразность применения клеток кордовой крови и препаратов фетоплацентарного комплекса для лечения ожоговых ран. Высокий пролиферативный потенциал стволовых клеток, содержание ростовых факторов в препаратах, стимулирующих деление клеток, пониженные антигенные свойства и бактерицидность делают биопрепараты уникальными и незаменимыми в комбустиологии.