Bunkové a tkanivové preparáty v regeneračnom lekárstve (liečba chorôb vyvolaných popálením).

Naša skúsenost’ v oblasti práce s preparátmi krvi sa opiera o viac ako 30-ročné pôsobenie, najmä realizáciu experimentálnych vyšetrovaní kriokonzervovania všetkých bunkových populácií periférnej krvi, mrtvolnej a darcovskej kostnej drene, hemopoetických buniek embryonálnej pečene živočíchov a človeka, kordovej krvi. Získané preparáty boli podrobené klinickému testovaniu a začali sa používat’ nielen v klinickej praxi, ale aj v dobytkárstve. Použitiu kordovej krvi na klinike predchádzala dlhá etapa experimentálnych vyšetrovaní v oblasti spracovania metodiky kriokonzervovania. Zvláštná pozornost’ bola venovaná podmienkam získania, úschovy a frakcionovania mononukleárov, a taktiež spracovaniu programu zamrazovania. V dôsledku toho boli zístené parametry režimu ochladenia, dlhotrvajúcej úschovy a rozmrazovania, dovolujúce udržiat’ 90-95% hemopoetických buniek kordovej krvi v životaschopnom stave.Treba zdôraznit’, že jedna vzorka kordovej krvi obsahuje 700-krát menej hemopoetických kmeňových buniek v porovnaní s ich počtom, potrebným pre transplantáciu dospelému recipientu, a preto bolo treba vylúčit’ straty buniek na všetkých etapách technologického procesu.

Kordová krv je najvhodnejšým zdrojom kmeňových buniek pre celý rad dôvodov. Po prvé nejestvujú žiadne etické problemy, ktoré by zakázovali jej získanie, po druhé viditel’nou je jednoduchost’ procedúry vyseparovania mononukleárov, po tretie počet obsahovaných v nej kmeňových a raných buniek-predchodcov nie je menší ak v kostnej dreni, a jej proliferatívny potenciál je dokonca väčší. Okrem toho pri porovnaní zloženia lymfoidných buniek periférnej a pupočníkovej krvi boli zístené základné rozdiely v ich subpopulačnom zložení: v pupočníkovej krvi prevládajú neaktivované, nezrelé bunky a bunky-supresóry, čo vylúčuje vyvoj choroby u subjekta podrobeného transplantácii, dokonca v prípade použitia kmeňových buniek pupočníkovej krvi s neúplnou НLA-kompatibilitou.

Svetové skúsenosti v oblasti použitia kmeňových buniek kordovej krvi v štruktúre liečby hemoblastózy, dedičných patológií krvotvorných buniek a chorôb nenádorového pôvodu sú dost’ značné, ale, ak to bolo zdôrazneno v mnohých prácach, spectrum pôsobenia buniek sa neobmedzuje len regeneráciou krvotvorného systému, reakcia organizmu na podanie preparátu je nepredvídaná: napríklad, l’ahko sa môžu odstraňovat’ patológie nervových buniek, taktiež sa môže regenerovat’ parenchyma pečene a bunky podžalúdkovej žl’azy, možná je aj normalizácia homeostázy atp.

Zvláštný záujem predstavuje populácia mezenchymálnych kmeňových buniek, ktoré, v prípade ich kultivovania v príslušnom prostredí, sa môžu transformovat’ v fibroblasty- bunky kostného, tukového a väzivového tkaniva.

Základným materiálom pre pestovanie buniek v kultúre sú mezenchymálne kmeňové bunky (CD34-), ktoré prvý raz vyseparoval prof. A. Fridenstein (Fridenstein et al., 1973) z kostnej drene.

CD34 sú negativné bunky-predchodca kostnej drene, ktoré môžu opúštat’ výklenky a vychádzat’ v system krvného obehu. Dostavajúc sa do zodpovedného mikroprostredia, ony začínajú signálno-regulačnú spoluprácu s vyspelými bunkami a tým vytvárajú stromálnu kostru, na ktorej sa môže uskutočňovat’ ich diferencovanie v gliálne tkanivo a fibroblasty. Cirkulujúce v krvi nezrelé mezenchymálne kmeňové bunky sa môžu vrácat’ do stormy kostnomozgového tkaniva a pretvárat’ sa v СD34-kladné hemopoetické bunky /Schuldiner, 2000/.

Taktiež bolo na príkladoch dokázano, že v prípade vzniku lokálnych poškodení mezenchymálne kmeňové bunky dostávajú signály, ktoré vysielajú poškodené bunky a ktoré aktivujú mechanizmy reparačnej regulácie. / Tavasolli et al., 1991/.

Prof. Šumakov, v spolupráci s inými vedeckými pracovníkmi, uskutočnil vyšetrovanie použitia alogénnych mezenchymálnych kmeňových buniek podobných fibroblastu za účelom liečby hlbokých popálenín (2003). Tie vyšetrovania ukázali, že v prípade použitia alogénnych mezenchymálnych kmeňových buniek podobných fibroblastu rýchlost’ hojenia úrazov bola väčšia, ak v prípade transplantácie embryonálnych fibroblastov. V dobe dvoch posledných desat’ročí sa začali používat’ kultivované alogénne keratonocyty a fibroblasty, autokeratinocyty a autofibroblasty s d’alšou dermoplastikou.

Mezenchymálne a krvotvorné kmeňové bunky boli najdené aj v kordovej krvi /Nieda M, Nicol A, Denning-Kendal P et. al. Endotelian cell precursors are normal component of human umbilical cord blood. Br J Haematol 1997; 98; 775-777/. Experimentálne výskumy ukázali, že v prípade dlhotrvajúceho kultivovania mononukleárov kordovej krvi endoteliálne bunky-predchodca iných druhov buniek, pod vplyvom určitých cytokinov, produkujú v kultúre kolónie fibroblastov.

Repopulačný potenciál hemopoetických buniek kordovej krvi bol potvrdzený početnými transplantáciami pri liečbe mnohých ochorení, vrátane aj aplastickej anémie. /Gluckman et al.,1997/.

Termická choroba (choroba vyvolaná popálením), ktorá sa vyvíja spolu s termickým úrazom, (viac ako 10% tela), zahrnuje komplex početných klinických syndrómov. To je, medzi iným, popaleninový šok, akútna kožná toxémia, septikotoxická períoda a períoda rekonvalescencie. Každá etapa ochorenia má príslušnú taktiku liečby.

Teraz, spolu s tradičnými metodami, sa začali používat’ biologické preparáty komplexného pôsobenia, ktoré majú za úkol obnovu homeostáze chorého, procesy reparácie a regenerácie poškodených zón pokožky a priebeh termickej choroby vcelku.

Tak, napríklad, pre liečbu a profylaxiu anémie v dobe popaleninového šoku sa používajú preparáty obsahujúce erythropoetin / Patent №458887 A61M1/38/. V dobe popaleninovej toxémie v prípade infekčných komplikacií sa aplikuje placentové tkanivo v akosti imunomodulátora.

V septikotoxickej perióde pri traumatickej výmene obväzu počas rozličných etáp liečby nekroektomie sa využíva placentové tkanivo v zložení masti, kým bunky chorionu sa využívajú v tvaru bunkovej suspenzie, ktorá sa aplikuje na poškodenú zónu (Preparát "суспензія клітин хоріону-suspenzia buniek chorionu" pre liečbu opálenín, spôsob jeho získania a spôsob liečby s pomocou tohto preparátu. 20040806939/К19.08.2004 A61K35/50).

V prípade rozsiahlých popálenín, trofického vredu, dlho nehojacích sa úrazov v fáze regenerácie a epitelizácie na poškodenú zónu sa nanáša kultúra fibroblastov a keratinocydov. Transplantácia kultúry buniek sa realizuje samostatne, v kombinacii s preparátmi obsahujúcimi kolagén alebo spolu s autodermoplastikou. /Parent №2002105467/.

Vlastné výsledky

Vyložené hore údaje, a taktiež aj vlastná skúsenost použitia kmeňových hemopoetických buniek v klinickej praxi /G.S. Lobyncevova, Ju.V.Gladkich a iní, Kmeňové embryonálne hemopoetické bunky človeka (teória a klinická prax), 2004/, dovolili doplnit’ obyčajnú procedúru liečenia pacienta s termickým úrazom komplexom preparátov, použitie ktorých, s ohl’adom na t’ažkost’ prípadu, môže priniest’ dobré výsledky (kresba.1) .

Kresba 1

Chorý N., 51 r., sa dostal do kliniky s rozsiahlou popáleninou na 36% tela. Hlboká termická spálenina vyvolala u pacienta popáleninovú chorobu 3-4 stupňa, ktorá sa charakterizovala t’ažkým popáleninovým šokom, popáleninou dýchacích ústrojov, sepsou a septickou pneumóniou. (kresba 2).

Kresba 2

Za účelom vyvoja anemického stavu u chorého na druhý deň, za podmienok prudkého poklesu obsahu hemoglobínu, erytrocytov a leukocytov s pomocou odkvapkávačky do žíl boli podané kriokonzervované kmeňové bunky kordovej krvi s proporciou 0,2х109 buniek s jadrom (kresba 3)

Kresba 3

Taktika liečby chorých s rozsiahlými poškodeniami pokožky IIIВ- IV stupňa za účelom zníženia intoxikácie a predchádzania komplikaciam predvída odstraňovanie poškodenej pokožky.

Kresba 4

Na druhý deň boli urobené dekompresné rezy (kresba.4), a na štvrtý deň blokovo-fasciálná excisia nektorického tkaniva (8% celkového povrchu pokožky pacienta) na bruchu a prsiach (kresba 5 ).

Kresba 5

Na poškodenej zóne v oblasti brucha a hrudníka bola aplikovaná suspenzia epiteliálnych buniek s proporciou 1-2 х106 /ml a potom táto zóna bola pokrytà chorionovým tkanivom. (kresba 6).

Kresba 6

V dôsledku realizovaných manipulácií termín, predchádzajúci uskutočňovaniu autodermoplastiky, bol skratený o 6 – 7 dní. Autoimúnne reakcie na použitie biologických preparátov neboli zístené, čo dalo autotransplantátu možnost’ sa ujat’ bez odmietnutia tkaniva a jeho lyzisu. To pomohlo k úschove obmedzených vlastných zásob pokožky.

Granulácia a epitelizácia prebiehali zrýchlene a bez výrazného zápalového procesu, čo vyvolalo zníženie vytvárania deformujúcich jaziev a kontraktúr.

Kresba 7

Úraz, na ktorom boli použité biopreparáty, zostaval čistý, bez evidentnej plazmorei. Okrem toho bolo zísteno, že v zónach aplikácie embryonálnych epiteliálnych buniek pokrytých kriokonzervovaným chorionovým tkanivom proces hojenia úrazu prebiehal značne rychlejšie ak v prípade bez týchto procedúr. Povrch úrazu v miestách hlbokého poškodenia pokožky sa pokryval rovnou vrstvou granulózneho tkaniva, vnútri ktorej sa môžu vidiet’ úseky s rozrastaním terminálnych zavies cievnej siete (kresba 7)

Na 17 deň úraz bol prípravený na realizaciu autodermoplastiky (kresba .8,9).

Kresba 8

Počas obväzovania boli ziskané odtlačky, na ktorých sa vidia bunky s dlhými filopodiami, vel’kými jadrami a 1-2 jadierkmi.

Oblast’ l’avej ruky po odstraneniu pokožky bola pokrytá chorionovým tkanivom, po realizácii jeho lizisu na ranu boli nanesené fibroblasty vypestované v kultúre.

Výsledky vyšetrovania periférnej krvi chorého v čase jedného mesiaca ukázovali stabilnú dýnamiku a chýbanie anemického stavu (úroveň hemoglobínu a erytocytov- kresba12)

Kresba 9

Neboli zístené základné zmeny biochemických parametrov (kresba 10).

Krátkodobé zväčšenie všeobecnej bielkoviny bolo reakciou na transplantáciu autopokožky.

Kresba 10

Kreatinína a pečeňové vzorky vzaté za účelom ich lekárskeho testovania zostávali stabilnými počas celého procesu liečby.

Použitie biologických preparátov zahrnuje mechanizmy fyziologickej regenerácie a zápalovej proliferácie v oblasti popáleniny. Prítomnost’ kmeňových buniek v chorionovom materiáu nevylučuje možnost’ ich migrácie a proliferácie v oblasti popáleniny.

V dôsledku tých procesov my môžeme pozorovat’ vytváranie špecializovaného granulózneho tkaniva a elementov spojujúcich tkanivo. Faktory rastu, ktoré obsahuje chorionové tkanivo, stimulujú proliferáciu buniek granulózy a fibroblastov.

D’alšie pozorovanie priebehu procesu ujatia sa autopokožky ukázalo, že v pozorovaných prípadoch nedochádzalo k komplikaciam spojeným s odmietnutím transplantántov, a taktiež že pokožka zostávala hladkou a lesklou. (kresba 11 ).

Kresba 11

V tento spôsob naši bádatelia ešte raz potvrdili účelnost’ využitia buniek kordovej krvi a preparátov fetoplacentového komplexu pre liečbu popálenín. Vysoký proliferačný potenciál kmeňových buniek, prítomnost’ v preparátoch faktorov rastu stimulujúcich delenie buniek, znižené antigénne vlastnosti a schopnost’ pôsobenia ako baktericídny prostriedok-to všetko dovol’uje povedat’, že tie biopreparáty sú unikátne a nezamenitel’né v kombustológii.